희망

Apr 19, 2024

커뮤니케이션 생물학 6권, 기사 번호: 474(2023) 이 기사 인용

1651 액세스

21 알트메트릭

측정항목 세부정보

극저온 집중 이온 빔(cryo-FIB) 밀링 기술은 현장 극저온 전자 단층 촬영(cryo-ET)에 의한 연구를 위해 냉동 원시 표본의 극저온 라멜라 제작을 위해 개발되었습니다. 그러나 관심 대상의 정밀도는 여전히 적용을 제한하는 주요 병목 현상 중 하나입니다. 여기에서는 3D 구조화 조명 형광 현미경(SIM) 시스템과 업그레이드된 고진공 스테이지를 통합하여 효율적으로 표적화된 저온 FIB를 달성함으로써 HOPE-SIM이라는 저온 상관 광전자 현미경(cryo-CLEM) 시스템을 개발했습니다. cryo-SIM의 3D 초해상도와 당사의 cryo-CLEM 소프트웨어인 3D-View를 사용하면 관심 영역 타겟팅의 상관 정밀도가 후속 극저온 제조에 충분한 110nm에 도달할 수 있습니다. 우리는 HOPE-SIM 시스템을 성공적으로 활용하여 미토콘드리아, HeLa 세포의 중심체 및 감염된 BHK-21 세포의 헤르페스 바이러스 조립 구획을 표적으로 하는 저온 라멜라를 준비했습니다. 이는 미래 현장 저온 ET를 위한 HOPE-SIM 시스템의 높은 효능을 시사합니다. 워크플로.

3차원(3D) 세포 미세구조를 밝히는 것은 생명을 이해하는 데 중요한 단계입니다. 최근 몇 년 동안 저온전자현미경(cryo-EM)은 점점 개선되어 거대분자 복합체1의 고해상도 3D 구조를 연구하는 데 사용되는 주요 생물물리학 기술 중 하나가 되고 있습니다. 또한, 저온전자단층촬영(cryo-ET)은 거의 원자 분해능을 달성할 수 있는 잠재력을 가지고 교란되지 않은 세포 환경의 거대분자 조직을 시각화하는 또 다른 강력한 도구로 등장했습니다. 극저온 ET를 통해 유리화된 세포의 세포내 미세구조를 시각화하기 위해 극저온 조건(cryo-FIB)에서 집중 이온빔 밀링을 사용하여 유리화된 세포에서 얇은 극저온 라멜라를 준비하여 세포 내부의 많은 흥미로운 생물학적 관찰을 가능하게 했습니다. 세포골격5,6,7,8,9, 소포체(ER)10 및 26S 프로테아좀11과 같은 세포 소기관의 3차원 조직이 cryo-ET에 의해 성공적으로 분석되었습니다.

관심 있는 기능을 찾고 식별하는 데 어려움을 포함하여 cryo-ET의 광범위한 적용을 방해하는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 극저온 상관광 및 전자 현미경(cryo-CLEM)13,14,15,16,17,18은 형광 라벨링을 활용하여 후속 극저온 FIB의 표적을 향해 이동함으로써 이 문제를 극복하는 효과적인 접근 방식임이 입증되었습니다. 유리화된 세포의 밀링 또는 냉동 수화 섹션의 극저온-ET 이미징. 세포의 정상적인 두께가 300keV 전자의 평균 자유 경로를 훨씬 넘어서는 점을 고려하면, cryo-ET 데이터 수집 전에 ~200nm 두께의 유리화된 세포를 제작하는 것이 필요합니다. 따라서 유리화, 저온형광현미경(cryo-FM), 저온FIB 및 저온ET의 순차적 실험 절차는 많은 현장별 현장 구조 연구를 위한 일상적인 워크플로우가 되었습니다. 23. 이 워크플로우에는 일반적으로 저온 형광 이미징15,16,17,24,25을 위한 저온 단계가 있는 독립형 형광 현미경과 저온 주사 전자 현미경(cryo-SEM)이 필요합니다. 극저온 FM과 극저온 SEM 이미지 간의 상관 정렬이 생성되어 극저온 FIB 밀링을 안내하는 데 사용됩니다. 또한 특정 3D 상관 소프트웨어를 사용하여 상관관계 정렬을 위해서는 저온-FM 및 저온-FIB에 의해 이미지화된 특정 기준 마커(예: 형광 비드)가 필요합니다. 극저온 광시야 형광 현미경13,21,22 또는 고해상도 극저온 Airyscan 공초점 현미경(CACM)12을 개발하여 이 워크플로우를 실현하는 것으로 보고된 많은 하드웨어 구현이 있었습니다.

극저온 FM과 극저온 FIB 사이의 상관관계 정확도와 성공률은 극저온 FM의 분해능에 의해 제한되며 시편 변형, 실투 및 얼음 오염 요인에 의해 더욱 약화됩니다7,21. 우리는 이전에 통합 극저온 홀더와 특정 진공 챔버를 활용하여 얼음 오염을 최소화하고 극저온 FM 이미징 및 검체 이송. 그러나 NA(개구수) 대물렌즈가 낮고 HOPE 시스템에서 형광 타겟의 z 위치 정보가 없는 광시야 형광 현미경을 사용하면 상관 정확도가 1미크론 이상으로 제한되어 개선이 필요합니다. 현장별 극저온 FIB 밀링 성공률을 높이기 위해